克隆性造血引起血浆循环游离DNA基因检测假阳性
本帖最后由 虎光着 于 2018-8-1 16:00 编辑血浆循环游离DNA（cfDNA）基因组分析被越来越多地临床应用于晚期癌症的无创基因检测。美国FDA已经批准了Cobas EGFR Mutation Test v2、MSK-IMPACT和FoundationOneCDx等液体活检基因检测方法。
然而肿瘤组织和血浆循环游离DNA之间的不一致性妨碍了这些新方法的应用和解读。引起不一致性的原因可能有：（1）脱落到血浆中的肿瘤DNA是可变的；（2）肿瘤异质性。
由于大部分血浆循环游离DNA提取于外周血细胞，非恶性造血细胞，比如克隆性造血的体细胞突变可能引起血浆循环游离DNA基因检测假阳性。
KRAS突变美国哈佛大学丹娜法伯癌症研究院的Geoffrey R. Oxnard等使用数字PCR法（ddPCR）检测了58例EGFR突变非小细胞肺癌患者的外周血浆，其中2例患者同时检出KRAS突变。
第1例患者是一位78岁的女性晚期非小细胞肺癌，确诊时检出血浆中EGFR Del 19和KRAS G12D突变。患者服用特罗凯20个月取得持久的缓解，血浆中EGFR 突变被清除，然而KRAS突变一直存在，见图1。腹部B超，CT和结肠镜并没有发现隐匿性肿瘤。以往文献报道过极少数克隆性造血患者存在KRAS突变，因此重新检测了配对外周血细胞和血浆，发现KRAS G12D突变等位基因分数在外周血细胞中为0.5%，血浆中为1.2%。对外周血细胞进一步检测发现，KRAS突变仅存在于淋巴细胞中，使用二代测序验证了数字PCR的结果，而且没有发现其它肿瘤相关基因突变，证明这位患者血浆中的KRAS突变源自淋巴系祖细胞的获得性基因突变和克隆增殖。
第二例患者是一位61岁的女性晚期非小细胞肺癌，手术切除标本检出EGFR L858R突变和KRAS突变阴性。患者服用特罗凯耐药后，使用二代测序检测血浆循环游离DNA，检出KRAS G12S突变，然而未检出EGFR L858R突变，数字PCR法验证了这一结果。外周血细胞中同样检出G12S突变，EGFR L858R突变仍为阴性。使用二代测序检测特罗凯耐药后的肿瘤组织，发现EGFR L858R和T790M突变，却未检出KRAS突变。
TP53突变使用二代测序检测来自丹娜法伯癌症研究院122例晚期非小细胞肺癌患者的143份血浆样本，检出14个与克隆性造血相关的三种基因突变（JAK2、GNAS和IDH2），其中6份为JAK2 V617F突变，该突变在非小细胞肺癌中罕见（仅0.26%）。使用数字PCR检测了其中5份的配对外周血细胞样本，都检出JAK2 V617F突变。使用二代测序检测3份血浆样本JAK2 V617F突变的配对肿瘤组织样本，JAK2 突变均为阴性。
TP53突变非小细胞肺癌患者中很常见，同时也存在于克隆性造血患者中。在143份血浆样本中检出108个TP53突变。7份血浆样本中检出超过2种TP53突变，而在配对的肿瘤组织样本中仅检出一种。33个TP53突变具有配对的肿瘤组织、血浆和外周血细胞样本，其中14个TP53突变在肿瘤组织和血浆样本中检出，而在外周血细胞样本中未检出；另外有5个TP53突变在血浆和外周血细胞样本中检出，而在肿瘤组织样本中未检出，提示这些TP53突变源自克隆性造血的基因突变克隆；另外有14个TP53突变在血浆样本中检出，而在肿瘤组织和外周血细胞样本未检出，由于其中13个TP53突变的血浆样本中等位基因分数≤0.5%,接近方法的检出限，结果难以验证。
讨论如果经合格的血浆循环游离DNA基因检测方法，检出与克隆性造血无关的EGFR、BRAF和MET等肺癌驱动基因，结果是可信的，可以应用相应的靶向药物治疗。然而如果血浆样本中检出KRAS和TP53突变，这可能是源自克隆性造血，需要经外周血细胞和肿瘤组织样本的基因检测的对照验证。
使用数字PCR和二代测序检测血浆循环游离DNA具有无创和高灵敏度的优点，但对检测结果应谨慎解读。
克隆性造血人类拥有 1 万~2 万个造血干细胞，每天能分裂产生 1000 亿个新的血细胞，每个细胞约 10 年便会产生一个突变。这些基因突变与年龄密切相关，老年女性中比例更高，40岁以下者发生率极低。尽管其中大多数突变为无功能的过客基因突变，不增加造血细胞克隆的扩张潜能。但部分突变基因为驱动基因或血液肿瘤相关基因，其突变可导致造血干细胞获得增殖和自我更新优势。
5394例实体瘤患者中，25%存在克隆性造血。放化疗和吸烟将增加克隆性造血的发生率。克隆性造血理论上可能导致继发血液肿瘤的风险增高，但在这些患者中罕见。
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